大家好！今日为大家介绍一篇发表在NatureBiotechnology上的一篇文章，题目为“High-throughputsingle-cellactivity-basedscreeningandsequencingofantibodiesusingdropletmicrofluidics”。主要介绍一种利用液滴分选方法对单细胞分泌抗体能力直接表征，并结合单细胞测序技术，快速筛选具有特异性结合能力的单抗。该文章对血液内的原始免疫细胞进行高通量的液滴分选得到具有高分泌IgG能力的单细胞，分选出的单细胞可以分泌特异性结合抗原表型的抗体。之后对筛选得到的细胞进行单细胞测序，得到抗体重链和轻链的序列，并对其进化差异进行分析，从而迅速的得到期望的抗体。该方法还可以快速地对细胞分泌的抗体进行多种生物学表征，包括与可溶性抗原的结合，交叉反应，细胞表面抗原结合，靶标活性抑制，细胞内化，细胞信号通路的调节等。该文章通讯作者为法国PSLResearchUniversity的AndrewD.Griffiths?、巴斯德研究所PierreBruhns?和HiFiBiO生物医药公司的ColinBrenan。
本文的部分工作原理，已在年Nat.Biotech上发表（Nat.Biotechnol.，35,–），提出了一种对液滴内包裹的单细胞分泌能力进行直接表征的方法。细胞分泌的抗体等物质被磁珠捕获，绿色荧光标记的抗原与红色荧光标记的二抗分别与磁珠表面的抗体结合。待反应后，液滴通过平行磁场，磁珠在液滴内被平行磁场聚集成一条竖线，其表面的荧光也被聚集而放大。液滴通过检测点时，可以得到增强的荧光信号，而没有细胞包裹或者细胞不分泌相应抗体的液滴，在通过检测点时，检测到弱荧光信号。本文中在继承之前的单细胞分泌抗体的检测及分选方法外，额外增加了对单细胞的基因型的研究。如图1所示通过单细胞测序，深入分析了高分泌抗体表型的细胞的基因，从而建立表型-基因型的对应文库，用于后续生成特异性抗体。图1.IgG分泌细胞表型的筛选与分类。如图2所示，作者使用了破伤风*素（tetanustoxoid,TT）和葡萄糖磷酸酶（GPI）作为水溶性抗原模型，跨膜蛋白8（SPAN8）作为细胞膜蛋白模型。平台高通量的特性被充分利用，在每秒2千个液滴生成速度下，将1百万原始脾细胞分配到4百万的液滴内。液滴内含有包裹抗Igk抗体的小磁珠，游离的Fluor标记的IgG抗体以及游离的Fluor标记的抗原。细胞分泌的抗体会被磁珠上抗Igk抗体捕获，若液滴内细胞分泌的为IgG抗体，则Fluor标记的抗IgG抗体会被富集到磁珠上，若该IgG抗体具有抗原特异性则Fluor的抗原也会被富集到磁珠上。此时磁珠分别带有和的荧光。如图1中d和h所示，在原始脾细胞中分别得到2.7%和2.8%的抗原特异性阳性信号，和47%和28%的IgG阳性信号。经过液滴分选后，回收的细胞使用标准ELISopt方法测定，有56%具有持续分泌特异性IgG的能力。
对回收后的细胞，使用barcode的方法进行单细胞测序，对其中重链和轻链的序列进行基因型分析。经过生物信息学分析后，对TT、GPI、TSPAN8分别鉴定出95，72，35个基因型。从5只小鼠的的脾细胞文库中，共得到个TT免疫性的基因型，这相比于传统elisa的测定方法，具有通量上和速度上的优势。在亲和力的测定后显示，多个单克隆抗体与TT的亲和力从0.1nM到nM不等，与GPI的亲和力从0.2nM到26nM不等，而与TSPAN8的亲和力为nM到nM。
图2.平台工作原理。作者发展了一种CelliGO的平台，用于筛选大量细胞中具有分泌特异性抗体表型的细胞。通过前端液滴的分选，将具有可分泌特异性结合能力的IgG表型的细胞进行富集；再通过单细胞测序，对细胞重链和轻链进行基因型层面的分析。该平台不仅可以对水溶性抗原进行筛选，还可以对膜蛋白抗原进行筛选，这些特性使其具有探究免疫反应和鉴定功能性抗体的应用前景。
1.Mazutis,L.etal.Single-cellanalysisandsortingusingdroplet-basedmicrofluidics.Nat.Protoc.8,–().2.Eyer,K.etal.Single-celldeepphenotypingofIgG-secretingcellsforhigh-resolutionimmunemonitoring.Nat.Biotechnol.35,–()撰稿人：LXER原文连接：