TinaCascone,WilliamNWilliam,AnnikkaWeissferdt,CheukHLeung,HeatherYLin,AparPataer,MyrnaCBGodoy,BrettWCarter,LorenzoFederico,AlexandreReuben,MdAbdulWadudKhan,HitoshiDejima,AlejandroFrancisco-Cruz,EdwinRParra,LuisaMSolis,JunyaFujimoto,HaiTTran,NedaKalhor,FrankVFossella,FrankEMott,AnneSTsao,GeorgeBlumenschein,XiuningLe,JianjunZhang,FerdinandosSkoulidis,JonathanMKurie,MehmetAltan,CharlesLu,BonnieSGlisson,LaurenAverettByers,YasirYElamin,RezaJMehran,DavidCRice,GarrettLWalsh,WayneLHofstetter,JackARoth,MaraBAntonoff,HumamKadara,CaraHaymaker,ChantaleBernatchez,NadimJAjami,RobertRJenq,PadmaneeSharma,JamesPAllison,AndrewFutreal,JenniferAWargo,IgnacioIWistuba,StephenGSwisher,JJackLee,DonLGibbons,AraAVaporciyan,JohnVHeymach,BorisSepesi
摘要
Ipilimumab联合nivolumab治疗转移性非小细胞肺癌(NSCLC)可改善临床疗效，但其疗效和对可手术NSCLC免疫微环境的影响尚不清楚。我们报道了44例可手术非小细胞肺癌患者接受新辅助剂nivolumab或nivolumab?+?ipilimumab的2期临床试验Neostar(NCT)的结果，以主要病理反应为主要研究终点。每个治疗组的MPR率与新辅助化疗的历史对照进行比较。Nivolumab?+?ipilimumab组21名患者中达到了预先指定的6个MPR的主要终点阈值，实现了38%的MPR率(8/21)。我们在nivolumab组中观察到22%的MPR率(5/23)。在37例受试者中，nivolumab和nivolumab?+?ipilimumab的mpr率分别为24%(5/21)和50%(8/16)。与nivolumab相比，nivolumab?+?ipilimumab的病理完全缓解率(10%vs38%)更高，肿瘤存活率更低(中位数50%vs9%)，效应者、组织驻留记忆和效应者记忆T细胞的频率更高。肠道反刍球菌和阿克曼氏菌丰度增加与MPR至双重治疗相关。我们的数据表明，基于新辅助nivolumab?+?ipilimumab的治疗增强了病理反应、肿瘤免疫浸润和免疫记忆，值得在可手术的非小细胞肺癌中进一步研究。
超过50%的可手术非小细胞肺癌患者仅手术后就会复发。围手术期(新辅助或辅助)化疗仅能适度(约5%)改善5年总存活率(OS)，并且是*性的来源，说明在这种情况下需要新的治疗方法。我们逐渐意识到在可手术的非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，MPR(切除肿瘤标本中≤10%的肿瘤存活)与新辅助化疗和改善生存结果之间存在正相关，这促使人们努力在这种情况下测试新的新辅助治疗策略，包括免疫检查点抑制剂。针对细胞*性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)及其配体(PD-L1)的免疫检查点抑制剂已经改变了晚期非小细胞肺癌患者的治疗标准。研究表明，nivolumab(抗PD-1)和ipilimumab(抗CTLA-4)通过不同的、非冗余的细胞机制增强抗肿瘤免疫，为将ipilimumab加入nivolumab治疗晚期NSCLC患者提供了理论依据。在晚期非小细胞肺癌患者中，nivolumab+ipilimumab的有效率高于nivolumab单一疗法。在晚期NSCLC患者中，一线nivolumab+ipilimumab治疗也比化疗产生更长的OS。尽管在nivolumab治疗的基础上加用ipilimumab已经极大地改变了晚期NSCLC患者的治疗，但这种双重ICI疗法对可切除的NSCLC免疫微环境的影响尚未确定。在本研究中，我们以MPR为主要终点，检测了新佐剂nivolumab和nivolumab+ipilimumab的临床活性，并评价了其免疫应答。
Neostar是一项2期随机临床试验(NCT)。试验的第一部分包括两个完全的、平行的、随机的新辅助单抗治疗(A组，3mgkg?-1静脉注射(i.v)，第1天(D1)，d15和d29每14天一次)和nivolumab+ipilimumab(b组，nivolumab3mgkg?1i.v，d1，d15和d29每14d静脉注射一次，ipilimumab1mgkg?1i.v)，试验的第一部分包括两个完整的随机对照试验，分别在d1、d15和d29静脉注射新辅助nivolumab3mgkg?1和ipilimumab1mgkg?1。仅在第1天)，随后手术切除原发肿瘤并进行淋巴结清扫和辅助标准治疗(扩展数据图1)。试验的主要终点是每个研究组中意向治疗(ITT)人群的MPR率。被认为有希望进行进一步测试的治疗组的预先指定界限是每组21名可评估患者的≥6MPR，这是基于新辅助铂类化疗的历史对照，其应答率约为15%。次要和探查终点在扩展数据图1中列出。主要和次要终点出现在ITT人群和每个手臂中切除的亚组中。在每条手臂上都有可用于生物标记物分析的样本的患者中，相关的终点被提出和描述。报道的比较结果在性质上是探索性的，也是假设产生的。
扩展数据图1
试验方案。可切除、经病理证实的临床I-IIIA期(N2单站)非小细胞肺癌患者按分期分层，并按1：1比例随机加入新佐剂nivolumab，每14天静脉注射3mg/kg，最多3剂(A组；D1、D15和D29)，或ipilimumab每6周1mg/kg静脉注射，每14天静脉注射nivolumab3mg/kg，最多3剂(B组；仅使用ipilimumab，D1，nivolumab)，最多3剂(组B；仅使用ipilimumab，d1，nivolumab)，最多3剂(组B；仅使用ipilimumab，d1，nivolumab。标准护理、辅助化疗和/或术后放射治疗由治疗医生自行决定。试验的主要终点是MPR，定义为切除的肿瘤样本中≤10%的存活肿瘤。选择的次要终点包括*性、围手术期发病率和死亡率、RECISTv.1.1的客观应答率(ORR)、生存结果、根治性切除率(R0)、病理完全应答率(PCR)(定义为切除肿瘤标本中0%存活的肿瘤)以及切除肿瘤组织中TIL的定量。选择的探索性终点包括生物标志物的分析和治疗对它们的调节。在治疗前(第一次注射前)和最后一次新辅助治疗后至少14天(手术切除后)进行CT和PET-CT扫描的影像学研究。肿瘤样本在治疗前和手术时与肿瘤邻近的未受累肺组织一起收集。治疗前和治疗后(手术前)采集粪便样本。在治疗前、剂量2和3之前、治疗后(手术前)和手术后8周内采集纵向血样。NSCLC，非小细胞肺癌；ECOGPS，东方合作肿瘤学小组表现状况；MPR，主要病理反应；ORR，客观应答率；RFS，无复发生存率；OS，总生存率；R0，完全手术切除；PCR，病理完全应答；TIL：肿瘤浸润淋巴细胞。D：治疗日。CT：计算机断层扫描，PET-CT：正电子发射断层扫描-计算机断层扫描。
结论
参与者：从年6月到年11月，53名患者同意进行试验并进行资格筛选。所有患者在治疗前均提供书面知情同意书，该试验符合所有相关的伦理审查。9名患者被认为筛查失败，但44名符合条件的患者接受了这项研究，其中23人随机接受nivolumab单一治疗，21人接受nivolumab+ipilimumab治疗(扩展数据图2)。患者特征和治疗安排如表1所示。总体而言，41名患者(93%)完成了计划中的新辅助治疗方案(nivolumabARM22名(96%)，双重治疗19名(90%))。三名患者没有完成计划的新辅助治疗：一名在nivolumab组，两名在nivolumab+ipilimumab组(扩展数据图2)。在nivolumab组中，一名患者在服用一剂nivolumab(非手术)后出现3级治疗相关缺氧和大量非恶性胸腔积液，需要住院治疗。在nivolumab+ipilimumab组中，一名患者出现与治疗相关的3级腹泻/结肠炎，需要在一剂联合治疗(试验外手术)后住院。另一名患者在接受nivolumab+ipilimumab两剂治疗后出现与治疗相关的2级肺炎，需要住院治疗；第三次计划剂量被扣留，该患者接受了试验手术。17例(46%)患者接受术后化疗，4例(11%)患者接受术后放疗(PORT)(表1)
扩展数据图2
报告试验的综合标准(CONSORT)流程图。流程图描绘了患者在整个研究阶段的处理情况，包括筛查、随机选择新辅助治疗和手术。筛查失败的原因，没有完成计划的新辅助治疗和没有进行手术，或在试验之外进行的手术都被显示出来。SAE，严重不良事件，TRAE，与治疗相关的不良事件；PD，进展性疾病；PS，表现状态。
在接受至少一剂新辅助ICIS试验的44名患者(ITT)中，39名患者在试验前后接受了治疗性手术，5名患者没有接受手术(11%，n=1个nivolumab；n=4个nivolumab+ipilimumab)(扩展数据图2)。在39例接受切除的患者中，37例(95%)接受了试验中的手术(n=21例nivolumab；n=16例nivolumab+ipilimumab)，2例(5%)在接受额外的系统治疗后切除(n=1例nivolumab；n=1例nivolumab+ipilimumab)。因此，在ITT分析中，共有7名患者被认为没有接受过试验中的手术(没有MPR)。
新佐剂nivolumab和nivolumab+ipilimumab的临床活性。在所有44名随机的ITT患者中，由两名独立和训练有素的病理学家在nivolumab组的22%(5/23，95%可信区间=7-44%)和双重治疗组的38%(8/21，95%CI=18-62%；P=0.；图1a)中观察并评估MPR的主要终点。因此，nivolumab+ipilimumab在21例患者中达到了预先指定的≥6MPR的界限，被认为是有希望进行进一步评估的。nivolumab治疗后病理完全缓解2例(2/23，9%，95%CI=1-28%)，nivolumab+ipilimumab治疗6例(6/21，29%，95%CI=11-52%；P=0.；图1a)。在接受nivolumab单一治疗(5个PR；图1b)后，ITT患者的放射学客观有效率(ORR，部分缓解(PR)+CR)为22%(5/23，95%CI=7-44%)，在nivolumab+ipilimumab治疗后为19%(4/21，95%CI=5-42%)(1个CR和3个PR；1名接受治疗的患者不可评价；P=1.0；图1c和补充表1)。
由于治疗但未在试验中切除的患者缺乏组织标本(ITT分析中n=7)，我们进行了敏感性分析，以评估在研究中切除的患者的MPR和PCR比率。在37例接受切除的患者中，nivolumab治疗后的多药耐药率为24%(5/21，95%CI=8-47%)，而nivolumab+ipilimumab治疗后的多药耐药率为50%(8/16，95%CI=25-75%)(P=0.；图1d)。尼伏单抗单独治疗后PCR率为10%(2/21，95%CI=1-30%)，而联合治疗后PCR率为38%(6/16，95%CI=15-65%)(P=0.；图1d)。在一项探索性分析中，与nivolumab治疗的肿瘤相比，nivolumab+ipilimumab治疗后切除的肿瘤标本含有较少的存活肿瘤细胞(P=0.；图1e)。
在37名接受切除的患者中，双臂的ORR为19%(nivolumab，4/21CR/PR(95%CI=5-42%)；nivolumab+ipilimumab，3/16CR/PR(95%CI=4-46%)；P=1.00；补充表2)。我们发现放射学肿瘤反应(CR/PR)与切除患者的MPR呈正相关(扩展数据图3)。所有切除的CR/PR患者(7/7；95%CI=59-%)在手术时实现了多药耐受，相比之下，30例接受手术的稳定期/进展期(SD/PD)患者中有6例(20%；95%CI=8-39%)(P=0.；补充表3和图1f，g)。然而，也有一些患者在放射学上达到SD，但在手术中有MPR或明显的病理肿瘤消退(图1f，g)。在一些病例中，我们在新辅助ICIS后，分别在计算机断层扫描(CT)和正电子发射断层扫描(PET)-CT再扫描中注意到结节病变进展的X线表现，表现为淋巴结增大和/或氟脱氧葡萄糖(FDG)摄取增加。然而，肿胀结节的侵袭性病理检查显示免疫细胞浸润改变(非干酪性肉芽肿)，但没有恶性改变，我们称之为结节免疫肿胀(NIF)11。ICIS后NIF现象的详细影像和病理特征将另行报道。
图1
新辅助剂nivolumab和nivolumab?+?ipilimumab在ITT和试验切除患者中的病理和放射学反应。A、ITT人群的病理反应(切除和未切除患者，nivolumab，n?=?23，nivolumab?+?ipilimumab，n?=?21)。主要终点：≤(PCR10%活肿瘤细胞)由PCR10%活瘤细胞组成，即0%活瘤+1-10%活瘤。MPR和PCR率是用精确的95%的顺函数从二项分布中估计出来的。双侧P值分别来自χ-2检验和Fisher‘s精确检验。在试验中，7名╬患者在接受新辅助治疗后没有接受手术。在这些患者中，5名患者(1名nivolumab，4名nivolumab?+?ipilimumab)没有手术；2名患者在额外的系统治疗(1名nivolumab；1名nivolumab?+?ipilimumab)后进行了非试验手术。A0%存活肿瘤(PCR)；b1-10%存活肿瘤。B、c、瀑布图显示，在最后一剂新辅助治疗后至少14?d，nivolumab(B)和nivolumab?+?ipilimumab(C)组(nivolumab，n?=?23，22%ORR；nivolumab?+?ipilimumab，n?=?21，19%orr；#一名患者在研究中不可评估)的总肿瘤大小的放射百分比变化。20%处的黑虚线表示PD的截止点。?30%点处的黑色虚线表示PR的分界点。*表示由于存在扩大的和/或新的病变而导致的PD的总体反应；┼表示实质性病变小于1?cm，被认为是SD。白色箭头表示没有接受手术的患者；黑色箭头表示一名患者在接受化学免疫治疗后进行了非试验阶段的手术。#有一名患者在服用一剂Nivolumab?+?ipilimumab后出现3级腹泻/结肠炎，因此在研究中无法进行放射学评估(在新辅助铂双重化疗期间和之后进行重新扫描，然后进行手术，两次都是在试验外进行)。D.在接受新辅助治疗的患者中，mpr/nompr(≤10%存活肿瘤/10%存活肿瘤)和pcr/nopcr(0%存活肿瘤/0%存活肿瘤)的比例分别为n?=?21(亮蓝/浅蓝)和nivolumab?+?ipilimumab(n?=?16，亮红/浅红)。双侧P值分别来自χ-2检验和Fisher‘s精确检验。即Nivolumab(n?=?21，蓝色)和Nivolumab?+?ipilimumab(红色，n?=?16)后切除的肿瘤标本中的存活肿瘤百分比。肿瘤存活中位数：nivolumab50%(范围0-97.5%，n?=?21)，nivolumab?+?ipilimumab9%(范围0-74.5%，n?=?16)。数据以中位数表示，包括最小值、上下四分位数和最大值。虚线表示中位数；虚线表示下四分位数和上四分位数；小提琴曲线图的顶部和底部表示最小值和最大值。双侧P值来自Wilcoxon秩和检验。新辅助剂nivolumab(f；n?21)和nivolumab?+?ipilimumab(g；n?=?16)切除患者的病理肿瘤消退(活肿瘤百分率%)的F，g，瀑布图。黑虚线表示MPR。
图2
接受新辅助nivolumab?和nivolumab??+?ipilimumab治疗的患者的生存结果。新辅助nivolumab?(n?=?23)治疗患者从随机到死亡的OS概率的Kaplan-Meier曲线。未达到中位数操作系统。一名接受新辅助nivolumab?治疗的患者，最终被诊断为需要类固醇的肺炎，由于bpf和脓胸导致呼吸衰竭，他在手术后90?d内和随机分组后4.1?月内死亡。B，新佐剂Nivolumab?+?ipilimumab(n?=?21)治疗患者从随机到死亡的OS概率的Kaplan-Meier曲线。未达到中位数操作系统。1名接受联合治疗的患者在随机分组(新辅助治疗后)后出现PD2.6?，没有接受手术。这位患者在接受额外治疗后的随机分组后死于肺癌，死亡时间为17.1月(?)。从随机到复发或死亡，接受新辅助尼伏单抗(n?=?23)治疗的患者发生肺癌相关RFs的概率的卡普兰-迈耶曲线。未达到肺癌相关RFS的中位数。如上所述，一名患者死亡。两名患者在随机分组后分别在20.0?月(n?=?1)和12.6?月(试验中无手术，n?=?1)后因局部和/或远处转移而出现肺癌相关复发。D，卡普兰-迈耶曲线显示接受新辅助尼伏卢单抗?+?ipilimumab(n?=?21)治疗的患者发生肺癌相关RFs的概率从随机到复发或死亡。
图3
肿瘤PD-L1在恶性肿瘤细胞中的表达与新佐剂Nivolumab和Nivolumab?+?ipilimumab疗效的关系。A、b、治疗前肿瘤PD-L1IHC膜蛋白表达率(%)：尼伏鲁单抗和尼伏单抗?+?治疗有效和无效的恶性细胞(a；CR/PR与SD/PD；n?=?4vsn?=?23)和mpr状态(b；n?=?8vsn?=?19)。数据以中位数表示，包括最小值、上下四分位数和最大值。显示单个数据点；虚线显示中间值，虚线显示下四分位数和上四分位数值；小提琴曲线图的顶部和底部表示最小值和最大值。双侧P值来自Wilcoxon秩和检验。C，d，治疗后(切除)肿瘤PD-L1IHC在接受尼伏鲁单抗和尼伏鲁单抗?+?ipilimumab治疗的应答者和无效者的恶性肿瘤细胞中的表达(c；n?=?3vsn?=?20)和mpr状态(d；n?=?4vsn?=?19)。数据以中位数表示，包括最小值、上下四分位数和最大值。显示单个数据点；虚线显示中间值，虚线显示范围的下四分位数和上四分位数值；小提琴曲线图的顶部和底部表示最小值和最大值。双侧P值来自Wilcoxon秩和检验。E，f，苏木精-伊红(HE)显微照片(上图)显示接受尼沃卢单抗(E)或尼伏卢单抗?+?ipilimumab(F)治疗的恶性细胞中肿瘤PD-L1表达升高的患者的病理反应(mpr或pcr)的例子(下图)。与所展示的显微照片相关的实验和评分只进行了一次。G，h，在接受nivolumab(G)或nivolumab?+?ipilimumab(H)治疗的恶性细胞缺乏肿瘤PD-L1表达的患者中，缺乏病理反应(无mpr)的HE显微照片(上图)的例子(下图)。与所展示的显微照片相关的实验和评分只进行了一次。N/E，不可评估PD-L1，因为在分析的组织切片中缺乏存活的肿瘤细胞。
图4
新佐剂Nivolumab和Nivolumab?+?ipilimumab应答的免疫相关性。流式细胞术检测肿瘤切除后CD3+T细胞(CD45+)(A)、CD+TRM细胞(CD45+)、CD+TRM细胞(CD45+)(B)、CD+效应TRM细胞(CD3+CD45+CD8+)(C)和CD27-CD28+效应记忆性T细胞(CD3+CD4+)(D)的频率(上图)和代表性门(下图)的A-d值(上图)和代表性门图(下图)(A)、CD+TRM细胞(CD45+)CD4+细胞(B)、CD+效应TRM细胞(CD3+CD45+CD8+)(C)和CD27-CD28+效应记忆T细胞(CD3+CD4+)(D)。和n?=?12(D))和nivolumab?+?ipilimumab(红色；n?=?10(A)；n?=?10(B)；n?=?10(C)；和n?=?9(D))。数据以中位数表示，包括最小值、上下四分位数和最大值。所有小提琴曲线图都显示单个数据点；虚线表示中间值，虚线表示范围的下四分位数和上四分位数值；小提琴曲线图的顶部和底部表示最小值和最大值。双侧P值来自Wilcoxon秩和检验。与所给结果相关的实验和门控只进行一次。仅当父母门中存在超过个事件时，才执行子门控。E，免疫标记物的MIF染色的显微照片(分别为图1和图2)，在新辅助尼伏卢单抗和尼伏卢单抗?+?ipilimumab治疗前和切除的肿瘤中。与所展示的显微照片相关的实验和评分只进行了一次。F-h、CD3+T细胞(图1)(F)、CD3+CD8+T细胞(图2)(G)和CD3+CD8+CD45RO+T细胞(H)密度(No.。(n?=?8)和尼伏单抗?ipilimumab(红色；n?=?7)治疗后切除的肿瘤组织中的MIF染色结果显示，治疗前和治疗后切除的肿瘤组织中MIF染色的差异无统计学意义(P0.05)，但差异无统计学意义(P0.05)。双侧P值来自Wilcoxon的符号秩检验。
图5
新辅助剂Nivolumab和Nivolumab?+?ipilimumab治疗后血液和肿瘤的Tcr变化。治疗前(基线)外周血与新辅助Nivolumab(n?=?4，蓝色)和Nivolumab?+?ipilimumab(n?=?3，红色)切除肿瘤后TCR谱丰度的相关性。两侧的P值来自Spearman的等级-顺序相关。新辅助剂Nivolumab(蓝色)和nivolumab?+?ipilimumab(红色)后，切除的癌旁未受累肺(n?=?12)与切除的肿瘤(n?=?20)之间的B、c、TcR谱系丰富度(B)和克隆性(C)。数据以中位数表示，包括最小值、上下四分位数和最大值。所有小提琴曲线图都显示单个数据点；虚线表示中值，虚线表示范围的下四分位数和上四分位数；小提琴曲线图的顶部和底部表示极小值和极大值。双侧P值来自两个样本的学生t检验。D，e，经Nivolumab(N，n?=?5，蓝色)或Nivolumab?+?ipilimumab(NI，n?=?7，红色)治疗后，切除肿瘤的TcR谱系丰富度(D)和克隆性(E)与其匹配的切除的、癌旁未受侵的肺(n?=?12，紫色)相比增加和减少的患者所占比例。F，g，经新佐剂nivolumab(n?=?5，蓝)或nivolumab?+?ipilimumab(n?=?7，红)治疗后，配对切除的肿瘤与瘤旁未受累肺之间TCR谱丰度(F)和克隆性(G)的变化。H，I，配对治疗前和切除肿瘤后TCR谱丰度(H)和克隆性(I)的变化：新辅助剂nivolumab(n?=?4，蓝)或nivolumab?+?ipilimumab(n?=?3，red)。闭合点：MPR；开点：无MPR。
手术可切除性。在接受至少一剂新辅助ICIS试验的44名患者(ITT)中，总体切除率为89%(39名患者在试验中或试验外接受了根治性手术)。完全(R0)切除率为%。在5名未接受手术的患者中，1名患者接受了nivolumab组(4%；1/23)的治疗，4名患者接受了nivolumab+ipilimumab组的治疗(19%；4/21，与治疗相关的不良事件(TRAE)无关)。在nivolumab组，一名患者在接受一剂治疗后出现3级治疗相关缺氧和非恶性胸腔积液，需要住院治疗，随后手术风险增加。在nivolumab+ipilimumab组，1例PD，1例再次支气管镜检查时隆突肿瘤累及，认为不能再切除，1例因肺灌注不足和主动吸烟而被认为有很高的手术风险，1例拒绝手术。在两名接受非试验手术的患者中，一名IIIA期患者在服用三剂nivolumab后出现新的纵隔受累的放射学进展，治疗改为铂双联化疗+培布罗珠单抗(PembrolizumabOffTrial)。有趣的是，化疗免疫治疗后，明显放射学疾病进展的结节部位的活检未能确认转移，而是显示肉芽肿性炎症。这名患者随后接受了非试验阶段的手术。第2例IIA期患者在单剂nivolumab+ipilimumab治疗后出现TRAEⅢ级腹泻/结肠炎，因此改用新辅助铂双联化疗，并在试验结束后手术切除。接受手术切除的中位时间为最后一剂nivolumab后31d(范围21-87d)。在最后一次免疫治疗后，在试验中进行的8例手术(8/37；22%)被推迟到推荐的最长42d以上。
*性*性总体上是可控的，与已知的nivolumab和nivolumab+ipilimumab的安全性相比，没有新的安全问题。接受nivolumab治疗的患者中有13%(3/23)(两个事件发生在同一患者中)和10%(2/21)接受nivolumab+ipilimumab治疗的患者报告了3-5级TRAE(补充表4)。一名接受nivolumab治疗的患者术后出现肺炎和需要类固醇的肺炎，并被诊断为支气管胸膜瘘(BPF)和脓胸，最终导致呼吸衰竭和死亡。作为一系列并发症的结果，我们将BPF和死亡归因于类固醇治疗的肺炎。记录了9个严重不良事件(5个与治疗相关)(补充表5)。
新辅助nivolumab和nivolumab+ipilimumab后的生存结果。我们对44例患者进行了复发率和存活率的随访。在最后一次数据库锁定时(年2月25日)，随机化后随访的中位数持续时间为22.2个月。中位OS和肺癌相关无复发生存率(RFS)均未达到。一名接受nivolumab治疗的患者在手术后90d内死亡，在随机分组后4.1个月内死亡(图2a)。一名接受nivolumab+ipilimumab治疗的患者在随机化(非手术)后2.6个月出现帕金森病(图2b)，并在随机化后17.1个月死于该病。6名患者出现肺癌相关复发(图2c，d)。在接受新辅助nivolumab(补充表6和7)或nivolumab+ipilimumab(补充表8和9)治疗的患者中，根据肿瘤组织学、分期或吸烟状况，病理和放射学反应没有显著差异。肿瘤组织学对肺癌相关RF没有显著影响(扩展数据图4a)；然而，我们观察到，与I/II期疾病患者(P=0.；扩展数据图4b)和现在/以前吸烟者(P=0.；扩展数据图4c)相比，IIIA期疾病患者和从不吸烟者的肺癌相关RF更差。为了解决放射学和病理反应、端口和辅助化疗对疾病复发的影响，我们对肺癌相关的RFs进行了探索性的里程碑分析，没有进行正式的统计比较。这些分析显示，9例CR/PR患者中有1例死亡(1/9，11%)，34例SD/PD患者中有6例复发(6/34，18%)(扩展数据图4d)。在13例MPR患者中，1例死亡(1/13，8%)，在24例未发生MPR的患者中，3例进展(3/24，13%)(扩展数据图4e)。接受PORT和/或辅助化疗的患者与未接受PORT和/或辅助化疗的患者相比，事件数量没有显著差异(扩展数据图4f，g)。虽然与没有MPR的患者相比，有MPR的切除患者发生事件的数量较少是令人鼓舞的，但在更大的队列中进行验证和在更长的随访时间内进行评估是有必要的。
对新辅助nivolumab和nivolumab+ipilimumab的免疫应答。肿瘤细胞PD-L1的免疫组织化学检测结果显示，放射学有反应(CR/PR)和mpr的患者治疗前肿瘤组织中PD-L1的表达总体上高于SD/pd(P=0.；图3a，e-h)和无mpr的肿瘤(P=0.；图3b，e-h)。然而，在缺乏肿瘤PD-L1的治疗前标本的患者中也观察到了反应。与PD-L11%的肿瘤相比，治疗前肿瘤PD-L1表达≥为1%的切除标本中存活的肿瘤细胞也较少(扩展数据图5A)。相反，治疗后肿瘤PD-L1的表达与反应无关(图3c-h和扩展数据图5b)，在接受nivolumab或nivolumab+ipilimumab治疗的肿瘤治疗前后，表达PD-L1的恶性肿瘤细胞的百分比没有显著差异(扩展数据图6a)。用流式细胞仪对切除的肿瘤组织进行免疫分析，发现CD45+CD3+肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、CD3+CD4+CD+(非T调节T细胞)、CD3+CD8+CD+效应TRM细胞(P=0.；图4c)和CD3+CD4+CD27TRM细胞的?频率较高(P=0.；图4a)。治疗前后肿瘤标本多重免疫荧光染色显示，治疗前后CD_3~+(P=0.；图4e，f)和CD_3+CD_8+TIL(P=0.；图4e，g)均有显著升高，且治疗后肿瘤组织中CD_3+CD_8+CD_(45RO)+MemoryTIL有增高趋势(P=0.；图4e，h)。与治疗前相比，Nivolumab+ipilimumab还诱导了更多的其他免疫细胞群的肿瘤浸润，包括CD3+CD8+PD-1+T细胞，CD68+和CD68+PD-L1+细胞，CD3+CD8+GZB+和CD3+CD8FOXP3+T细胞，尽管这些增加与?无关(扩展数据图6B-I)。在单独使用nivolumab治疗的肿瘤中，从治疗前到治疗后没有检测到免疫细胞亚群的实质性变化(图4f-h；扩展数据图6)，而在接受nivolumab+ipilimumab治疗的肿瘤中，CD3+T淋巴细胞从治疗前到治疗后的变化明显高于仅使用nivolumab治疗的肿瘤(补充表10)。
少数样本的T细胞受体(TCR)测序结果显示，治疗前外周(血液)TCR谱系的丰富度与新辅助ICIS术后切除肿瘤的丰富度呈正相关(Spearman相关系数，R=0.82P=0.；图5A)，表明治疗前TCR谱系的丰富度与新辅助ICIS后切除肿瘤的丰富度呈正相关(Spearman相关系数，R=0.82P=0.；图5A)。切除的肿瘤的丰富度和克隆性比邻近的、未受累的肺标本高(分别为P=0.和P=0.；图5B，c)。我们观察到，与匹配的癌旁未受累肺标本相比，切除的肿瘤中有更大比例的TCR丰富度和克隆性更高(丰富度，83.3%(10/12)；克隆性，分别为67%(8/12)；图5D，e)，并且在接受nivolumab+ipilimumab治疗的肿瘤中观察到更多的肿瘤增加(图5F，g)。在接受双重治疗的三个肿瘤中，有三个肿瘤的T细胞丰富度和克隆性从治疗前到手术后增加，但仅在接受nivolumab治疗的四个肿瘤中的两个肿瘤(图5H，I)中增加了T细胞的丰富度和克隆性(图5H，I)。与治疗前的血液样本相比，接受联合治疗的大多数样本的血液T细胞丰富度增加，而治疗后的血液克隆性降低(扩展数据图7A，b)。肿瘤和外周TCR克隆性与病理肿瘤消退没有显著相关性，尽管在某些情况下趋势显示这两个变量之间呈负相关(扩展数据图7c-f)，尽管只有一个MPR样本可用于这些分析。我们在可用的治疗前和治疗后样本之间确定了显著扩张和收缩的TCR克隆，并确定与治疗前的血液样本相比，切除的肿瘤中最大数量的克隆被扩张和收缩(扩展数据图7g，h)。总的来说，这些结果表明，与nivolumab相比，nivolumab+ipilimumab诱导了更深刻的肿瘤免疫浸润和增强的免疫记忆，在少数病例中，与治疗前相比，切除的肿瘤中T细胞的丰富度和克隆性增加。
肠道微生物群的组成差异及其与治疗反应和*性的关系。我们使用目标16S核糖体RNA基因序列，对从接受研究治疗的患者的粪便样本中收集的肠道微生物组组成和多样性进行了探索性分析。我们质疑ICI治疗是否影响肠道微生物群的组成。加权UniFrac分析显示，在治疗前和治疗后的样本中，微生物群落之间的变异性相似，两组样本之间没有差异(R=?0.，P=0.99)，也没有MPR或TRAE状态的差异(扩展数据图8a，b)。然后，我们比较了手臂和家族水平的微生物群组成，发现在接受nivolumab或nivolumab+ipilimumab治疗的患者中，前十个最丰富的细菌家族的分布相似。用逆辛普森指数测量的微生物群多样性在nivolumab(P=0.；扩展数据图8c，d)和nivolumab+ipilimumab臂(P=0.；扩展数据图8e，f)的mpr状态下似乎也是相似的，尽管这些结果来自有限数量的样本。在“属”水平上进行线性判别分析效应大小(LEFSE)研究，以确定与MPR相关的分类群。处理臂的残留物分析表明，Paraprevoella和Akkermansiaspp.分别与nivolumab和nivolumab+ipilimumab臂中的MPR相关(扩展数据图8G)。在nivolumab+ipilimumab臂(扩展数据图8g，底板)的样本中，一株未分类的鲁米诺球菌sp.，在序列同一性上与R.bromii近亲，与MPR相关。我们还观察到Dialistersp.降低对nivolumab及双歧杆菌和肠杆菌属的*性。和一个未分类的白藜芦科属，降低了双重治疗的*性(扩展数据，图8H)。最后，我们利用Spearman相关性分析了治疗后肿瘤中粪便微生物菌群与TCR克隆性和丰富性的相关性。我们发现了与MPR或*性降低相关的属，包括阿克曼西亚属(Akkermansiasp.)。(r=0.44，P=0.05)和双歧杆菌属(Bifidobacteriumsp.)。(r=0.47，P=0.04)，与TCR克隆性呈正相关，而与MPR缺乏或*性增加有关的属，包括Coproces_3sp。(r=TCR0.48，P=0.04)、Lachnospaceae_UCG(R=?0.66，P0.)和Lachnospaceae_unclass(R=TCR0.47，P=0.04)与?克隆度呈负相关(扩展数据图9A，b)。与T细胞丰度相关的细菌有厌氧菌(AnAerofustissp.)。(r=0.58，P=0.)，假单胞菌属(Faecalibaculumsp.)。(r=0.61P=0.)和瘤胃球菌1sp.。(r=?0.65，P=0.)，以及其他(扩展数据图9C，d)。综上所述，这些结果表明，不同肠道细菌的丰富与新佐剂ICIS后的病理反应、*性降低以及在某些情况下更高的T细胞克隆性和丰富性有关。
讨论
Neostar是报道的第一个以MPR为主要终点，在38%可切除非小细胞肺癌患者中测试单一新辅助剂nivolumab和nivolumab+ipilimumab的随机2期试验。尼伏卢单抗+ipilimumab产生的MPR率高于历史记录，联合治疗与尼伏卢单抗治疗相比存活率低得多。*性情况总体上是可控的，没有新的安全问题。Nivolumab+ipilimumab可诱导CD3+和CD3+CD8+T淋巴细胞、TRM和效应记忆T细胞在肿瘤中的浸润。
从历史上看，新辅助化疗导致局部NSCLC4,6,7,12,13的MPR率在7%到27%之间。以前在新辅助环境下检测单药抗PD-1/PD-L1疗法的临床活性的研究报告了可切除的NSCLC14–16患者的MPR率在19%到45%之间。在本研究中，nivolumab单药治疗在23名接受治疗的患者中产生了22%的MPR，在21例切除的肿瘤中产生了24%的MPR。加入ipilimumab和nivolumab在切除患者中产生的MPR是单独使用nivolumab(50%比24%)的两倍，与nivolumab相比(38%比10%)产生更大比例的PCR。相比之下，几项新辅助铂双重化疗的临床试验报告的PCR中位数只有4%5，这表明不用化疗的方案更容易导致肿瘤完全消退。然而，新佐剂nivolumab+ipilimumab的MPR率的95%可信区间相对较大(18-62%)，这表明与单独化疗相比，样本量更大的进一步研究可以更准确地确定主要终点的增加幅度。
尼伏卢单抗+ipilimumab治疗的肿瘤免疫成分与单纯nivolumab治疗的肿瘤免疫成分不同。我们观察到联合治疗的肿瘤中T细胞浸润增强；然而，肿瘤的免疫细胞浸润与MPR无关。在黑色素瘤中使用更大剂量的ipilimumab的研究报告了应答肿瘤的免疫浸润增强17。在我们的研究中，一些肿瘤的病理反应程度使得它们无法进行分析，而从ipilimumab剂量到手术的较长时间可能并不符合最大的免疫细胞反应。我们注意到在接受nivolumab+ipilimumab治疗的肿瘤中，与单独接受nivolumab治疗的肿瘤相比，接受nivolumab+ipilimumab治疗的肿瘤中CD4+(非Treg)CD+和CD8+CD+TRM和效应记忆T细胞的频率更高。考虑到手术切除后早期肿瘤复发的趋势，这一观察结果特别鼓舞人心。据我们所知，这是首次报道新辅助ICIS在切除的NSCLC的临床标本中赋予免疫记忆。以前的研究表明，增强的CD8+CD+TRMTIL与早期NSCLC18和其他类型癌症患者的生存改善相关19。魏和他的同事20已经证明，CTLA-4和PD-1阻滞剂的联合治疗介导了从耗尽的CD8+T细胞到激活的效应CD8+T细胞的转换。在nivolumab中加入ipilimumab可能增强了具有免疫记忆表型的效应性T细胞的肿瘤浸润。
虽然我们发现应答患者的基线样本中肿瘤PD-L1表达总体较高，但我们也观察到缺乏预处理肿瘤PD-L1的患者的反应。同样，对可切除的新辅助化疗患者进行新辅助免疫治疗的研究也是对照。在ITT和切除的人群中，联合治疗也产生了比nivolumab更高的MPR率。此外，在接受切除的患者中，nivolumab+ipilimumab组的患者中只有10%的人在nivolumab组中进行了PCR检测，而在nivolumab组中这一比例仅为10%。非小细胞肺癌治疗后的肿瘤报告反应与PD-L1无关(参考文献)。说明需要在更大的队列中进行研究，以确定肿瘤PD-L1和反应之间的关系。
我们在小部分样本中进行的TCR测序结果表明，T细胞可能从治疗前的外周到治疗后切除的肿瘤中归巢。与邻近未受累的肺样本相比，在接受治疗的肿瘤中，更高比例的TCR丰富度和克隆性表明，在新辅助免疫检查点阻断后，切除的肿瘤可能具有更多样化的T细胞谱系，显性克隆的子集解释了更高的克隆性，尽管这些结果与反应无关。相反，在未接受治疗和切除NSCLC的患者中进行的研究中，观察到未受累的切除肺的TCR克隆率较高22。T细胞克隆从外周向切除肿瘤的扩张可能代表了新辅助治疗后优势克隆的招募；然而，还需要在更大的样本集合中进行进一步的研究。对其他癌症的研究表明，外周T细胞向邻近未受累组织和肿瘤的扩张是免疫疗法临床获益的关键决定因素23。Amaria及其同事17证明，在黑色素瘤患者中，基线时更多克隆的T细胞与对新辅助ICI治疗的反应相关，随着治疗的进行，先前存在的高频克隆进一步扩大。布兰克等人24发现，接受新佐剂nivolumab+ipilimumab治疗的黑色素瘤患者比接受辅助联合治疗的患者有更大的肿瘤驻留T细胞克隆扩增。
我们发现放射学和病理肿瘤反应之间存在正相关；然而，在某些情况下，影像低估了病理肿瘤消退的程度，强调了成像在准确捕捉新辅助治疗反应方面的局限性。我们先前已经证明，与CT的反应相比，新辅助化疗的组织病理学反应是改善生存结果的更强的预测因子13,25。在目前的研究中，我们还注意到一些患者出现了我们称之为NIF的现象。NIF的特征是新辅助ICIS后淋巴结组织学阴性、肿大和/或FDG增强的淋巴结疾病进展的影像学表现。治疗后肿大/扩张结节的侵袭性病理检查显示免疫细胞浸润和肉芽肿，没有恶性的证据11。在假性放射学结节进展可能妨碍手术的情况下，侵入性再分期使我们能够继续进行根治性手术。
16SV4rRNA基因序列分析表明，ICIS对微生物群落的多样性、结构和组成没有显著影响。然而，定性的生物标志物发现分析表明，较高丰度的瘤胃球菌。在治疗前样本中，mpr与nivolumab+ipilimumab有关。最近的研究表明，黑色素瘤患者对ICIS的反应与粪便反刍球菌科的较高多样性和相对丰度有关26。我们还发现阿克曼藻属(Akkermansiaspp.)的丰度较高。在基线样本中，mpr与nivolumab+ipilimumab相关，与切除肿瘤的TCR克隆性呈正相关。同样，在先前的研究中，在接受ICIS治疗的黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾癌患者中，粘液阿克曼氏菌与良好的临床结果相关26,27。我们的结果支持粪便微生物群在调节肿瘤对ICIS的反应中的作用。
我们的研究有一定的局限性。它没有能力正式测试两个治疗组之间的临床活动和免疫反应的差异，而是将两个组的肿瘤反应与历史上新辅助化疗的对照进行比较。报道的比较结果是探索性的和假设产生的，包括我们肠道微生物组定性和相关分析的结果，需要进一步的研究，例如通过定量测量和更深层次的分类学和功能表征来验证所建议的生物标志物细菌。治疗前和治疗后的样本数量以及与MPR相关的切除肿瘤组织的数量是有限的。尽管有这些局限性，但据我们所知，这是第一个完成的随机研究，比较了新辅助nivolumab单一疗法和nivolumab+ipilimumab联合治疗对可切除NSCLC的影响。联合治疗后切除的患者中50%的MPR率是有希望的，并为更大规模的研究中的进一步评估提供了一个平台。在转移性非小细胞肺癌患者中，一线应用nivolumab+ipilimumab导致OS持续时间比化疗更长，与PD-L1表达无关10,28。这些发现以及Neostar的研究结果表明，在可切除和转移性非小细胞肺癌中，nivolumab+ipilimumab联合使用可能是一种不需要化疗的方案。
我们发现这两种武器之间的差异令人信服。NADIM和新辅助剂阿替唑单抗+化疗的最新研究结果表明，联合化疗和ICI可能提供额外的临床益处。基于这些结果，以及CHECKMATE9LA研究的最新结果，显示在晚期非小细胞肺癌患者中，一线nivolumab+ipilimumab与单独化疗相比存活率提高，我们的研究为评估目前正在测试的新辅助化疗中加入双重ICIS的作用奠定了基础(NCT)。
综上所述，我们的研究结果提供了证据，证明在nivolumab中加入ipilimumab可以产生更高的MPR和PCR率，并增强肿瘤免疫浸润和免疫记忆。在可切除的非小细胞肺癌患者的围手术期环境中，nivolumab和ipilimumab的联合应用值得进一步研究。
扩展数据图3：新辅助ICIS后，治疗组和MPR状态下肿瘤大小较基线的变化。A，b，盒子图描绘了ITT(A)中接受治疗臂新辅助治疗的患者(A)和切除患者(B)的肿瘤测量从治疗前(基线)到切除患者(B)的百分比变化之间的联系。在一名患者中，接受三剂尼伏卢单抗治疗后，实质性病变小于1厘米，与基线相比没有变化；反应被认为是SD。1例患者在服用一剂nivolumab加ipilimumab后出现TRAE(SAE)，RECIST反应和肿瘤大小较基线的百分比变化无法评估。ITT患者：Nivo，n=22，Nivo+Ipi，n=20。切除患者：MPR，n=13，无MPR，n=23。数据以中位数表示，包括最小值、上下四分位数和最大值。长方体的两端是上下四分位数(75%和25%)，中间是长方体内部的水平线。胡须是长方体外延伸到最大值和最小值的两条线。双侧P值采用Wilcoxon秩和检验。C，d，NSCLC用nivolumab(C)前后和nivolumab加ipilimumab(D)前后的X线(CT扫描)和病理(HE)图像的例子。CR，完全应答；PR，部分应答；MPR，主要病理应答；PCR，病理完全应答；VT，肿瘤存活；CT，CT；HE，苏木精-伊红。
扩展数据图4：新辅助治疗nivolumab和nivolumab加ipilimumab后，组织学、分期、吸烟状况、反应和术后治疗对肺癌相关RFs的影响。肿瘤组织学研究新佐剂nivolumab和nivolumab加ipilimumab后肺癌相关RFs发生概率的Kaplan-Meier曲线。腺癌26例(26/44，59%)，进展4例(4/26，15%)；鳞癌/鳞癌18例(18/44，41%)，进展/死亡3例(3/18，17%)。新佐剂nivolumab和nivolumab加ipilimumab治疗后肺癌相关RFS发生概率的Kaplan-Meier曲线。I期23例(52%)，进展1例(1/23，4%)，II期12例(12/44，27%)，进展/死亡2例(2/12，17%)，IIIA期9例(9/44，20%)，进展4例(4/9，44%)。吸烟情况下新佐剂nivolumab和nivolumab加ipilimumab后肺癌相关RFs发生概率的Kaplan-Meier曲线。36例既往/现吸烟者(36/44，82%)中，3例(3/36，8%)进展，8例不吸烟者(8/44，18%)中，4例(4/8，50%)进展/死亡。D，Kaplan-Meier曲线用于探讨新佐剂nivolumab和nivolumab加ipilimumab的放射学(RECIST)反应对肺癌相关RFs的影响。9例CR/PR患者(9/44，20%)中，1例(1/9，11%)死于激素治疗后的肺炎合并BPF、脓胸和呼吸衰竭；34例SD/PD患者中，6例(6/34，18%)复发，其中1例死于本病。1例患者在服用一剂nivolumab加ipilimumab后，由于出现3级TRAE而无法评估。E，Kaplan-Meier曲线来自里程碑式的分析，以探索对新佐剂nivolumab和nivolumab加ipilimumab的病理反应(MPR与非MPR)对肺癌相关RFs的影响。13例MPR患者中，1例(1/13，8%)于术后2.2个月死亡；24例无MPR患者中，3例(3/24，13%)分别于术后15.0、16.4、17.9个月进展。F，Kaplan-Meier曲线进行里程碑式分析，探讨新佐剂nivolumab和nivolumab加ipilimumab后Port对肺癌相关RFs的影响。接受PORT治疗的4例患者中，进展2例(2/4，50%)，未接受PORT治疗的33例患者中，进展/死亡2例(2/33，6%)。G，Kaplan-Meier曲线进行里程碑式分析，以探讨新辅助化疗对新辅助nivolumab和nivolumab加ipilimumab后肺癌相关RFs的影响。17例接受辅助化疗的切除患者中，2例进展(2/17，12%)；20例未接受辅助化疗的切除患者中，2例进展/死亡(2/20，10%)。SCC，鳞状细胞癌；ASC，腺鳞癌；从不，从不吸烟者；以前/现在，曾经吸烟者/现在吸烟者；CR，完全缓解；PR，部分缓解；SD，稳定期疾病；PD，进展性疾病。MPR，主要病理反应；N/E，不可评价。港口，术后放射治疗。双侧P值来自logrank检验。
扩展数据图5
肿瘤PD-L1在恶性肿瘤细胞中的表达与对新佐剂nivolumab和nivolumab加ipilimumab的反应之间的关系。根据治疗前(A)和治疗后(B)肿瘤PD-L1IHC在恶性肿瘤细胞中的表达(1%比≥1%)，治疗前(A)和治疗后(B)nivolumab和nivolumab加ipilimumab治疗后切除的肿瘤标本中的a，b，存活肿瘤百分率。治疗前肿瘤PD-L11%，n=16；≥1%，n=8；治疗后肿瘤PD-L1：1%，n=13，≥1%，n=10。所有小提琴曲线图都显示单个数据点，虚线表示中间值，虚线表示范围的下四分位数和上四分位数值；小提琴曲线图的顶部和底部表示极小值和极大值。与提出的结果相关的实验和评分只进行了一次。双侧P值采用Wilcoxon秩和检验。
扩展数据图6：治疗前后肿瘤免疫浸润的多重免疫荧光(MIF)Vectra染色。a-f，MIFVectra面板1中共表达标记的细胞群染色为(A)PD-L1+恶性细胞(%)，(B)CD3+CD8+T细胞(n/mm2)，(C)CD3+PD-1+T细胞(n/mm2)，(D)CD3+CD8+PD-1+T细胞(n/mm2)，(E)CD68+细胞(n/mm2)，(F)CD68+PD-Lm2。在MIFVectraPanel2中共表达标记的细胞群染色为(G)CD3+T细胞(n/mm2)，(H)CD3+CD8+GZB+T细胞(n/mm2)，(I)CD3+CD8-FOXP3+T细胞(n/mm2)与接受nivolumab(n=8)或nivolumab+ipilimumab(n=7)治疗前的肿瘤患者相比，(G)CD3+CD8+FOXP3+T细胞(n/mm2)，(H)CD3+CD8+GZB+T细胞(n/mm2)，(I)CD3+CD8-FOXP3+T细胞(n/mm2)。与提出的结果相关的实验和评分只进行了一次。双侧P值采用Wilcoxon符号秩检验。
扩展数据图7
新辅助治疗后T细胞克隆的变化及其与肿瘤病理消退的相关性。a，b，配对血样经新佐剂nivolumab(n=4，蓝色)或nivolumab加ipilimumab(n=3，红色)治疗前后(术前)TCR谱系丰富度(A)和克隆性(B)的变化。C-f，肿瘤(c，d)或血液中T细胞克隆性(e，f)与手术中存活肿瘤百分率的相关性(c，e)，以及新佐剂nivolumab(蓝色)和nivolumab+ipilimumab(Red)治疗前(c，e)和治疗后(d，f)的相关性。双边P值来自Spearman秩次相关。配对切除肿瘤(手术肿瘤)与治疗前(n=7)、匹配切除肿瘤(手术肿瘤)与邻近未受累肺(手术未受累)(n=12)、匹配治疗后(手术前)与治疗前(n=7)血液样本中，T细胞克隆数显著增加(G)和收缩(H)(经Benjamini-Hochberg校正，双侧P0.01)，(G)和(H)T细胞克隆数显著增加(G)和收缩(H)，其中匹配切除肿瘤(手术肿瘤)与非手术受累肺(n=12)、匹配治疗后(手术前)与治疗前(n=7)T细胞克隆数显著增加(G)和收缩(H)。在新佐剂nivolumab(蓝色)和nivolumab加ipilimumab(红色)治疗后，匹配的切除肿瘤(手术肿瘤)与治疗前血样(n=7)和肿瘤邻近未受累肺(手术未受累)与治疗前血样(n=7)。数据以中位数表示，包括最小值、上下四分位数和最大值。所有小提琴曲线图都显示单个数据点，虚线表示中间值，虚线表示范围的下四分位数和上四分位数值；小提琴曲线图的顶部和底部表示极小值和极大值。封闭点：MPR；开点：无MPR。
扩展数据图8
粪便微生物群多样性与肿瘤病理反应和TRAE之间的关系。主坐标分析(PCoA)的排序图用加权UniFrac距离表示患者治疗前(n=30)和治疗后(n=28)的粪便微生物群聚集型。双侧P值来自个排列的相似性分析(ANOSIM)检验，以计算这两个类别之间的分类组成是否存在显着差异。有微生物组数据的患者(n=25，mpr=9，nompr=16；治疗相关不良事件(TRAE)2=12，TRAEs≤2=13)内治疗前后样本之间的成对距离的盒子和胡须曲线图显示(n=25，mpr=9，无mpr=16；治疗相关不良事件(TRAE)2=12，TRAEsmpr2=13)。绘图的框部分从第一个四分位数绘制到第三个四分位数，内线表示中间值。胡须从长方体的末端延伸到最小和最大数据值。双侧P值采用Mann-WhitneyU秩和检验。在接受nivolumab治疗的患者中，mpr(n=3)和nompr(n=15)中观察到的家庭水平上最丰富的前10种细菌的相对分布的C，盒和胡须图(上图)。绘图的框部分从第一个四分位数绘制到第三个四分位数，内线表示中间值。胡须从长方体的末端延伸到最小和最大数据值。D，逆Simpson指数估计接受尼伏鲁单抗治疗的患者(下图)中MPR(n=3)和非MPR(n=15)之间的粪便细菌多样性。曲线图的框部分是从第一个四分位数到第三个四分位数生成的，内线表示中间值。胡须从长方体的末端延伸到最小和最大数据值。双侧P值采用Mann-WhitneyU秩和检验。Nevolumab加ipilimumab治疗组中MPR组(n=7)和非MPR组(n=8)家庭水平最丰富的前10位细菌的相对分布的盒子和胡须曲线图。曲线图的框部分是从第一个四分位数到第三个四分位数生成的，内线表示中间值。胡须从长方体的末端延伸到最小和最大数据值。F，逆Simpson指数估计在接受nivolumab和ipilimumab治疗的患者中，MPR(n=7)和没有MPR(n=8)之间的粪便细菌多样性。曲线图的框部分是从第一个四分位数到第三个四分位数生成的，内线表示中间值。胡须从长方体的末端延伸到最小和最大数据值。双侧P值采用Mann-WhitneyU秩和检验。G，线性判别分析(LDA)有效大小(LEFSE)用于评估治疗前尼伏卢单抗(Top)和尼伏卢单抗加ipilimumab治疗(下；MPR，n=7和无MPR，n=8)患者中MPR(n=3)和无MPR(n=15)患者在属水平上的粪便微生物群的区分特征。条形的长度表示与属相关的效果大小。用Kruskal-Wallis检验的Alpha值0.05和对数LDA评分2计算判别特征。按TRAE分类在属水平两两比较尼伏单抗治疗患者(上组)(TRAES≤2(n=10)和TRAE2(n=10))和尼伏单抗加依普利姆单抗治疗患者(下组)(TRAE≤2(n=9)和TRAE2(n=10))的细菌分类群两两比较的左图。用Kruskal-Wallis检验的Alpha值0.05和对数LDA评分2计算判别特征。
扩展数据图9：粪便微生物群多样性与肿瘤TCR克隆性和丰富性之间的关系。A，c，热图显示治疗前不同水平的nivolumab(n=10)和nivolumab加ipilimumab(n=9)手臂和治疗后肿瘤TCR克隆性(A)和丰富度(C)的分类丰度。B、d，用线性回归模型分析微生物群落与TCR克隆度(B)和丰富度(D)之间的关系。采用Spearman相关检验(双侧)计算Rho和P值。这里使用的是未经调整的P值截止值0.05。
扩展数据图10
CDT细胞和T细胞存储板的流式细胞仪门控策略。门控策略如图所示，包括初始QC门(SSCSinglet、FSCSinglet、活细胞)，然后是面板中包括的免疫细胞亚群。所示的每个次级小区群体的参考频率来自亲代门。如图所示，对CD4+Tregs、CD4+非Tregs和CD8+T细胞亚群进行亚门控。对组织驻留记忆(TRM)(CD+)和非TRM(CD-)T细胞亚群的检查点受体亚门也进行了评估。箭头表示通过各个门的过渡。B、CTLA-4、FoxP3、CD25、TIM3、PD-1和CD对照的荧光负1(FMO)门控。C，如图所示，在CD4+和CD8+T细胞亚群上执行T细胞存储面板的子门控(SubgateForTCellMemoryPanel)。箭头表示通过各个门的过渡。D，CD45RA、CCR7、CD28和CD27对照的荧光减一(FMO)门控。与所给结果相关的实验和门控只进行一次。仅当父母门中存在超过个事件时才执行子门控制。
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